海洋環(huán)境中硫酸鹽還原菌的快速測(cè)定方法研究

  “一帶一路”、“海洋強(qiáng)國(guó)戰(zhàn)略”等重大戰(zhàn)略規(guī)劃為我國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)帶來了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。海洋工程裝備和船舶在服役過程中不可避免的要遇到各種腐蝕問題，其中由微生物引起的，或者由于其群體效應(yīng)或代謝過程引起的腐蝕行為變化稱做微生物腐蝕。微生物腐蝕幾乎可以在所有常用工程材料表面發(fā)生，微生物腐蝕約占整個(gè)腐蝕的20%。作為微生物腐蝕研究的代表性微生物，也是研究最廣泛的腐蝕微生物，硫酸鹽還原菌 （SRB） 是一類能夠利用SO42-為電子受體異化有機(jī)物質(zhì)并從中獲取能量的微生物，其參與的腐蝕過程約占所有微生物腐蝕的50%[1,2]。SRB廣泛存在于海洋環(huán)境中，參與了工程材料在海洋底泥區(qū)、全浸區(qū)、潮差區(qū)和飛濺區(qū)的腐蝕過程，是一類不容忽視的腐蝕因子。

針對(duì)SRB加速腐蝕的機(jī)理研究已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)，目前已經(jīng)形成的機(jī)理包括陰極去極化機(jī)理、濃差電池機(jī)理、代謝產(chǎn)物機(jī)理、酸腐蝕機(jī)理和電子直接傳遞機(jī)理等[3,4,5,6]。SRB的代謝活性與其腐蝕行為密切相關(guān)是這些機(jī)理的共識(shí)觀點(diǎn)之一。如陰極去極化機(jī)理認(rèn)為，SRB能夠利用腐蝕陰極反應(yīng)產(chǎn)生的氫原子參與SO42-的代謝過程，進(jìn)而加速陰極反應(yīng)平衡的移動(dòng)，加速金屬的溶解過程。濃差電池理論認(rèn)為，SRB的生長(zhǎng)代謝過程會(huì)降低在材料附近氧氣的濃度，形成氧濃差電池，從而加速金屬材料的腐蝕過程。代謝產(chǎn)物機(jī)理認(rèn)為，SRB代謝產(chǎn)生的硫化物不僅本身對(duì)腐蝕反應(yīng)具有陰極和陽(yáng)極去極化作用，生成的硫鐵化合物也具有去極化作用，同時(shí)硫化物還會(huì)破壞氧化物保護(hù)膜生成局部酸環(huán)境。酸腐蝕機(jī)理認(rèn)為，SRB在代謝的過程中會(huì)不斷產(chǎn)生低碳鏈的脂肪酸，這些脂肪酸，最主要的是醋酸，會(huì)造成局部環(huán)境pH值降低，從而加速對(duì)金屬材料的破壞。電子直接傳遞機(jī)理認(rèn)為，自養(yǎng)型SRB能夠直接從金屬基底材料獲取電子參與其細(xì)胞代謝過程，導(dǎo)致腐蝕速率的顯著增加，而不產(chǎn)生氫消耗。

然而，現(xiàn)有研究仍無(wú)法明確SRB狀態(tài)對(duì)其腐蝕行為的影響程度和作用規(guī)律，其中一個(gè)重要原因是缺乏快速、準(zhǔn)確、連續(xù)的SRB狀態(tài)測(cè)定方法，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)獲取關(guān)于SRB的種群濃度、生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝效能信息。此外，受限于復(fù)雜的海洋環(huán)境，繁瑣的微生物腐蝕樣品采集流程，和電化學(xué)測(cè)試信號(hào)易被其它腐蝕行為掩蓋等困難，目前仍沒有合適的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)微生物腐蝕過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。有研究報(bào)道，工程材料表面SRB的種群濃度和代謝活性可以為微生物腐蝕的發(fā)生提供指示[7]。因此，開發(fā)新型快速的SRB狀態(tài)測(cè)定方法具有重要意義，能為深入揭示SRB在腐蝕過程中的作用機(jī)理，開發(fā)微生物腐蝕狀態(tài)的快速監(jiān)測(cè)技術(shù)提供重要依據(jù)。

目前，檢測(cè)SRB種群濃度最常用的方法還是傳統(tǒng)的最大可能數(shù) （MPN） 法，該方法是由Abd-El-Malek等[8]在1958年首次提出。該方法將SRB進(jìn)行逐級(jí)梯度稀釋后進(jìn)行定期培養(yǎng)，利用其代謝產(chǎn)生的硫化物與亞鐵離子反應(yīng)顯色確定SRB的存在，根據(jù)稀釋的倍數(shù)和呈現(xiàn)陽(yáng)性顯色樣品的個(gè)數(shù)確定初始樣品中SRB種群的濃度。雖然Vester等[9]在1998年對(duì)MPN法進(jìn)行了改進(jìn)，但該類方法仍然需要經(jīng)歷至少15 d才能完成整個(gè)檢測(cè)過程，且操作過程繁瑣，是一種既耗時(shí)又耗力的檢測(cè)手段；同時(shí)過長(zhǎng)的檢測(cè)周期，使其檢測(cè)結(jié)果并不能準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)地反映環(huán)境中SRB的種群數(shù)量，不利于施工和殺菌措施的調(diào)整。除最常用的MPN法外，目前已報(bào)道的其它SRB檢測(cè)技術(shù)手段可以分為：基于SRB特征物質(zhì)的檢測(cè)方法，基于SRB細(xì)胞的檢測(cè)方法以及基于SRB遺傳物質(zhì)的檢測(cè)方法，這些檢測(cè)技術(shù)均存在一定的缺陷與不足。例如，基于SRB特征化合物 （如腺苷酰硫酸還原酶） 的檢測(cè)方法靈敏度及選擇性均不高，且需要破壞SRB細(xì)胞結(jié)構(gòu)[10]；基于SRB細(xì)胞識(shí)別的檢測(cè)方法 （如酶聯(lián)免疫標(biāo)記法） 受生物識(shí)別材料與生物標(biāo)記材料的活性影響較大，檢測(cè)信號(hào)不穩(wěn)定[11]；基于分子技術(shù) （如聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性） 的分析方法需要較高的檢測(cè)成本和專業(yè)人員操作[12]。因此，現(xiàn)有的SRB檢測(cè)技術(shù)均存在普遍性與穩(wěn)定性的不足，距離實(shí)際需求仍有較大的距離。

此外，目前常用的SRB活性測(cè)定方法是通過分析培養(yǎng)體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況和硫化物的積累量進(jìn)行分析[13,14]，該類方法受環(huán)境影響較大，尤其在開放體系研究時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和硫化物的揮發(fā)均會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生較大影響。同時(shí)，該類方法測(cè)定的是體系中SRB種群整體的代謝活性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)材料表面固載細(xì)菌和溶液游離細(xì)菌活性的獨(dú)立測(cè)定和區(qū)分。另一類基于微電極傳感器的活性測(cè)定方法是通過解析生物膜表面硫化物的濃度變化確定SRB生物膜活性，然而該類方法對(duì)儀器設(shè)備和操作的要求較高[15,16,17]，不適合現(xiàn)場(chǎng)和大規(guī)模應(yīng)用。因此，現(xiàn)有測(cè)定技術(shù)均不能滿足實(shí)際研究和應(yīng)用的需求，無(wú)法快速、準(zhǔn)確、連續(xù)的獲得SRB的活性狀態(tài)信息，開發(fā)新型的SRB代謝活性測(cè)定方法已成為微生物腐蝕研究的迫切需求。

事實(shí)上，海洋環(huán)境與SRB代謝過程非常復(fù)雜，目前常用SRB分析測(cè)量技術(shù)易受到非特異性吸附和干擾物質(zhì)的影響，檢測(cè)的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性會(huì)有一定程度的降低。另一方面，現(xiàn)代科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用對(duì)微生物檢測(cè)的需求已從單一宏觀信號(hào)提升為單細(xì)胞的觀測(cè)與分析，檢測(cè)過程與結(jié)果需更加生動(dòng)、形象。因此，引入其它新型檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)環(huán)境中SRB種群濃度和代謝活性的快速檢測(cè)分析已十分必要。

本文將簡(jiǎn)要介紹本課題組在SRB種群濃度和代謝活性檢測(cè)方面的研究進(jìn)展，闡述各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)、適用條件及檢測(cè)性能，為后續(xù)SRB狀態(tài)檢測(cè)方法的發(fā)展及實(shí)用化提供參考。

1 SRB種群濃度快速測(cè)定方法研究進(jìn)展

針對(duì)現(xiàn)有SRB檢測(cè)方法的缺陷與不足，研究從微生物識(shí)別方式角度出發(fā)，實(shí)現(xiàn)了海洋環(huán)境中腐蝕微生物SRB的快速檢測(cè)，將整個(gè)SRB檢測(cè)流程縮短至2 d以內(nèi)，有望部分甚至完全取代現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，具有較好的應(yīng)用前景。

1.1 基于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)識(shí)別SRB的檢測(cè)方法

為提升檢測(cè)靈敏度及選擇性，研究以海洋腐蝕微生物SRB細(xì)胞膜為識(shí)別目標(biāo)，借助化學(xué)合成及電化學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了一系列快速檢測(cè)技術(shù)，保證了SRB細(xì)胞檢測(cè)的選擇性，縮短了檢測(cè)時(shí)間。主要進(jìn)展如下：構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記電化學(xué)快速檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了SRB的快速檢測(cè)，其中多巴胺自激發(fā)檢測(cè)平臺(tái) （圖1） 是通過多巴胺在堿性溶液中的自聚合反應(yīng)形成的聚多巴胺膜直接固定抗體作為識(shí)別平臺(tái)，提升了檢測(cè)平臺(tái)的生物相容性，保證了生物識(shí)別材料的識(shí)別活性及檢測(cè)選擇性[18]；三維泡沫鎳結(jié)構(gòu)檢測(cè)平臺(tái)是通過在三維鎳結(jié)構(gòu)修飾納米金顆粒為固定抗體作為識(shí)別平臺(tái)，提升了識(shí)別材料的固載效率，同時(shí)該三維結(jié)構(gòu)能夠有效放大檢測(cè)信號(hào)，有效提升了檢測(cè)靈敏度[19]；分子自組裝檢測(cè)平臺(tái)借助共價(jià)修飾結(jié)合無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)阻抗技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了SRB的檢測(cè)和分析，實(shí)現(xiàn)了SRB檢測(cè)平臺(tái)的有效構(gòu)建，并具有良好的檢測(cè)性能[20]。

圖1   多巴胺自激發(fā)檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建流程及檢測(cè)性能評(píng)價(jià)[18]

其次，構(gòu)建了納米信標(biāo)電化學(xué)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了SRB的快速檢測(cè)，其中氧化石墨烯標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái) （圖2） 是以高效新型納米材料氧化石墨烯納米片的高催化活性放大檢測(cè)信號(hào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的有效放大，大大提升了檢測(cè)靈敏度[21]；納米MnO2標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)是以MnO2納米材料作為信號(hào)標(biāo)簽，借助MnO2納米材料催化性能實(shí)現(xiàn)SRB檢測(cè)，具有更高的穩(wěn)定性和更廣的使用環(huán)境[22]；殼聚糖電聚合檢測(cè)平臺(tái)是通過可控的電沉積技術(shù)制備石墨烯摻雜的殼聚糖膜固定抗體作為識(shí)別平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了生物識(shí)別材料固載平臺(tái)的可控調(diào)控，保證了檢測(cè)平臺(tái)的穩(wěn)定性與均一性，同時(shí)具有較高的生物相容性[23]。

圖2   氧化石墨烯標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建流程及檢測(cè)性能評(píng)價(jià)[21]

此外，開發(fā)了新型SRB特異性識(shí)別平臺(tái)，其中生物印跡薄膜檢測(cè)平臺(tái) （圖3） 采用細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)在電極表面制備了能夠識(shí)別SRB細(xì)胞的生物印跡薄膜，該技術(shù)具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)[24]；抗生素磁性分離檢測(cè)平臺(tái)通過特異性識(shí)別SRB細(xì)胞壁前質(zhì)末端的D-Ala-D-Ala結(jié)構(gòu)契合，借助石英晶體微天平技術(shù)對(duì)SRB進(jìn)行測(cè)試分析。整個(gè)流程無(wú)需生物分子固定和修飾步驟，大大縮短了檢測(cè)所需時(shí)間[25]。多巴胺增強(qiáng)聚合檢測(cè)平臺(tái)是構(gòu)建了一種多功能的簡(jiǎn)便的信號(hào)放大體系，借助多巴胺材料增強(qiáng)聚合的過程實(shí)現(xiàn)生物材料及信號(hào)分子的有效固載，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的靶向放大，提升了檢測(cè)靈敏度[26]。

圖3   基于生物印跡薄膜檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建示意圖及檢測(cè)性能圖[24]

基于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)識(shí)別SRB的檢測(cè)方法靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)時(shí)間短，能夠在2 h以內(nèi)完成檢測(cè)過程，較易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。然而，大部分這類方法需要借助生物識(shí)別材料實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的特異性結(jié)合，生物材料的活性易受到測(cè)試環(huán)境的干擾，且生物材料價(jià)格昂貴，不能重復(fù)使用。另外，生物材料過高的特異性也限制了其在實(shí)際環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用，因?yàn)榄h(huán)境中SRB的種群數(shù)量巨大，目前已有40個(gè)屬137種SRB被報(bào)道，每一種SRB的細(xì)胞成分都不盡相同。因此，基于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)識(shí)別SRB的檢測(cè)方法適用于菌群結(jié)構(gòu)單一、環(huán)境體系簡(jiǎn)單的檢測(cè)體系。

1.2 基于微生物代謝過程識(shí)別SRB的檢測(cè)方法

為提升檢測(cè)穩(wěn)定性，研究以海洋腐蝕微生物SRB的特征代謝產(chǎn)物為識(shí)別目標(biāo)，構(gòu)建了一系列快速檢測(cè)技術(shù)。相關(guān)研究在保證了選擇性的同時(shí)，避免了使用生物識(shí)別材料出現(xiàn)的穩(wěn)定性差、價(jià)格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點(diǎn)。主要研究進(jìn)展如下：構(gòu)建了SRB代謝產(chǎn)物無(wú)標(biāo)記快速識(shí)別檢測(cè)技術(shù)，其中巰基蛋白酶活性條件檢測(cè)平臺(tái) （圖4） 是基于硫化物與半胱氨酸蛋白酶的活性巰基位點(diǎn)作用抑制其催化活性進(jìn)而實(shí)現(xiàn)SRB的檢測(cè)分析，既保證了檢測(cè)穩(wěn)定性，又提升了檢測(cè)靈敏度[27]；特異性微生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)利用Thiobacillus thioparus細(xì)菌內(nèi)的硫化氫脫氫酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB代謝產(chǎn)生的硫化物的特異性識(shí)別，大大提升了檢測(cè)穩(wěn)定性[28]；基于GSH-Au（Ⅰ）-Pb（Ⅱ） 配合物的熒光傳感器，是基于Pb2+誘導(dǎo)的GSH-Au（Ⅰ） 聚集誘導(dǎo)發(fā)光，以及硫化物導(dǎo)致熒光猝滅現(xiàn)象，可對(duì)SRB代謝產(chǎn)物產(chǎn)生特異性響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB的快速檢測(cè)[29]；硫化鉛標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)將無(wú)機(jī)合成與溶出伏安技術(shù)相結(jié)合，以原位生物硫化鉛為介體實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)微生物的靶向識(shí)別及快速檢測(cè)，具有良好的檢測(cè)性能[30]。

圖4   基于巰基蛋白酶抑制作用檢測(cè)SRB的原理及性能圖[27]

此外，構(gòu)建了基于納米信標(biāo)的SRB代謝產(chǎn)物快速識(shí)別檢測(cè)技術(shù)。其中，ZnS納米光催化檢測(cè)平臺(tái)將光催化過程應(yīng)用于微生物快速檢測(cè)，構(gòu)建過程融合了生物合成技術(shù)及光催化降解技術(shù)，既保證了檢測(cè)穩(wěn)定性，又有效提升了檢測(cè)靈敏度[31]；ZnO/ZnS陣列轉(zhuǎn)化檢測(cè)平臺(tái) （圖5） 將納米陣列過程引入微生物檢測(cè)過程，借助納米陣列的轉(zhuǎn)化過程實(shí)現(xiàn)了SRB特征代謝產(chǎn)物的有效監(jiān)測(cè)，該方法不受使用條件的限制，且具有批量生產(chǎn)的潛質(zhì)[32]；細(xì)胞代謝位發(fā)光平臺(tái)結(jié)合微生物納米合成技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)生成具有熒光特性的CdS納米量子點(diǎn)顆粒，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)微生物的熒光成像及快速檢測(cè)。該檢測(cè)技術(shù)穩(wěn)定、可靠，不受檢測(cè)條件的制約，具有很好的應(yīng)用前景[33]。

圖5   基于ZnO/ZnS陣列轉(zhuǎn)化檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)SRB的原理圖及檢測(cè)性能[32]

基于SRB特征代謝過程的檢測(cè)技術(shù)避免了使用生物識(shí)別材料出現(xiàn)的穩(wěn)定性差、價(jià)格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點(diǎn)。同時(shí)，通過特征代謝產(chǎn)物硫化物實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB的特異性快速檢測(cè)還具有較高的普遍性，源自不同種群的SRB均可以通過這種方法檢測(cè)。然而，基于SRB特征代謝過程的檢測(cè)技術(shù)需要經(jīng)歷一個(gè)SRB預(yù)培養(yǎng)過程以在培養(yǎng)溶液中富集足夠的硫化物，因此，需要借助納米材料或生物酶類的靈敏性和放大作用縮短檢測(cè)時(shí)間，這也是基于SRB特征代謝過程的檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展方向。

1.3 基于微生物特征遺傳片段的檢測(cè)方法

以提升檢測(cè)特異性及靈敏度，研究以微生物的特征遺傳片段為識(shí)別目標(biāo)，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)微生物的特異性DNA片段，利用DNA識(shí)別探針對(duì)微生物特征DNA片段的高選擇性匹配、識(shí)別目標(biāo)DNA片段，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的快速檢測(cè)。主要研究進(jìn)展如下：構(gòu)建了遺傳片段特異性放大檢測(cè)系統(tǒng)，其中核酸外切酶Ⅲ循環(huán)放大檢測(cè)平臺(tái)是一種新型的基于新型磁性-DNA雙鏈探針及核酸外切酶Ⅲ循環(huán)放大的檢測(cè)方法，通過在磁性微球表面修飾的磁性-DNA雙鏈探針，借助核酸外切酶Ⅲ特殊的剪切功能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的循環(huán)放大，該微生物檢測(cè)平臺(tái)的靈敏度高，選擇性好，簡(jiǎn)單易操作，應(yīng)用性廣[34]；DNA納米生物條碼熒光檢測(cè)平臺(tái) （圖6） 是通過利用細(xì)菌DNA提取試劑盒將細(xì)菌總DNA提取出來，并用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得大量含有特異性目標(biāo)片段的單鏈DNA，目標(biāo)DNA鏈片段能部分與磁性微球的捕獲探針結(jié)合，未結(jié)合部分將與磁性微球的捕獲探針結(jié)合。通過磁性分離后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)量結(jié)合有DNA-納米生物條碼的磁性微球[35]。

圖6   基于利用DNA納米生物條碼-熒光系統(tǒng)的檢測(cè)微生物原理圖及檢測(cè)性能圖[35]

此外，構(gòu)建了基于新型酶標(biāo)系統(tǒng)的遺傳片段特異性放大檢測(cè)系統(tǒng)，其中新型酶標(biāo)體系信號(hào)放大檢測(cè)平臺(tái) （圖7） 是一種基于溶菌酶催化作用的熒光DNA傳感器，溶菌酶被應(yīng)用到微生物檢測(cè)研究中。利用細(xì)菌DNA提取試劑盒將細(xì)菌中DNA提取、擴(kuò)增后獲得大量目標(biāo)單鏈DNA片段，通過目標(biāo)DNA鏈的“橋梁”作用將修飾有溶菌酶的信號(hào)DNA結(jié)合到磁性微球表面，溶菌酶催化底物產(chǎn)生熒光信號(hào)并用于微生物快速檢測(cè)[36]；基于脫氧核酶識(shí)別的銀納米簇?zé)晒鈧鞲衅?，是以磁性微球?yàn)檩d體，以脫氧核酶為識(shí)別分子，引入乙酰膽堿酯酶，構(gòu)建了一種MNP-DNAzyme-AChE （MDA） 復(fù)合物，用于微生物的高靈敏度檢測(cè)。在存在目標(biāo)細(xì)菌裂解液條件下，脫氧核酶可與其特異性結(jié)合，并發(fā)生催化裂解，使連接其上的乙酰膽堿酯酶，從MDA復(fù)合物中脫離進(jìn)入溶液。利用乙酰膽堿酯酶的催化產(chǎn)物，使DNA銀納米簇的熒光信號(hào)發(fā)生增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的高特異性、高靈敏度檢測(cè)[37]。

圖7   基于新型酶標(biāo)體系信號(hào)放大檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)微生物原理圖[36]

基于微生物特征遺傳片段識(shí)別微生物的檢測(cè)方法具有極高的靈敏度和選擇性，其中，16S rRNA序列分析中的基因片段具有多拷貝的特性，一個(gè)細(xì)菌對(duì)應(yīng)103~105條16S rRNA 鏈，使得基于編碼基因進(jìn)行的分子生物學(xué)檢測(cè)更靈敏；其次，其具有多信息的特性，編碼基因由可變區(qū)和保守區(qū)組成，保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有，細(xì)菌之間無(wú)差別，可進(jìn)行細(xì)菌通用鑒定，可變區(qū)具有屬或種的特異性，可據(jù)此進(jìn)行細(xì)菌鑒定。然而，此類方法操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求高，且操作成本較高。因此，基于微生物特征遺傳片段識(shí)別的檢測(cè)方法適用于高專業(yè)技術(shù)支撐下對(duì)不同屬種微生物的特異性鑒別及檢測(cè)體系。

2 SRB生物膜代謝活性快速測(cè)定方法研究進(jìn)展

為克服現(xiàn)有測(cè)定技術(shù)周期長(zhǎng)，儀器復(fù)雜的缺點(diǎn)，本課題組研究開發(fā)了新型SRB生物膜代謝活性測(cè)定方法，借助電化學(xué)和熒光測(cè)試技術(shù)實(shí)現(xiàn)了SRB生物膜在形成初期的代謝活性動(dòng)態(tài)測(cè)定與監(jiān)測(cè)。

2.1 基于全固態(tài)離子電極測(cè)定SRB生物膜代謝活性

電化學(xué)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)SRB生物膜代謝活性的動(dòng)態(tài)、連續(xù)監(jiān)測(cè)，然而現(xiàn)有的微電極系統(tǒng)操作繁瑣，設(shè)備昂貴。本課題組研究開發(fā)了兩種高柔韌性全固態(tài)離子選擇性電極，以石墨烯為離子-電子轉(zhuǎn)換層，并在其表面原位制備了硫離子和pH值選擇性薄膜，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)離子的特異性、高靈敏度測(cè)定，同時(shí)研究還將其用于生物膜前期代謝活性的監(jiān)測(cè)，獲得了材料表面SRB生物膜代謝活性的變化趨勢(shì) （圖8）。

圖8   全固態(tài)硫離子選擇性電極的離子傳導(dǎo)示意圖及SRB生物膜代謝活性監(jiān)測(cè)性能

2.2 基于熒光探針測(cè)定SRB生物膜代謝活性

本課題組研究開發(fā)了有機(jī)小分子硫化物熒光探針，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物膜中硫化物的穩(wěn)定檢測(cè)還能對(duì)其進(jìn)行特異性熒光成像，解析SRB生物膜內(nèi)代謝活性的空間分布狀態(tài)。此外，研究利用SRB細(xì)胞增殖過程中，呼吸鏈中的NADPH/NADP，F(xiàn)ADH/FAD，F(xiàn)MNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，SRB代謝中間體還原可將刃天青還原為具有強(qiáng)的熒光特性物質(zhì)，利用此特點(diǎn)來測(cè)定SRB生物膜代謝過程的活性變化，并實(shí)現(xiàn)了SRB種群濃度和活性狀態(tài)的同時(shí)測(cè)定和對(duì)照分析 （圖9）。

圖9   熒光探針測(cè)定SRB生物膜表面種群濃度和生物膜代謝活性

3 結(jié)論及展望

針對(duì)腐蝕微生物SRB的快速檢測(cè)要比構(gòu)建其它微生物檢測(cè)方法復(fù)雜，因?yàn)镾RB種群多種多樣，分布廣泛，目前已經(jīng)有13個(gè)屬，共計(jì)40余種SRB被報(bào)道出來。因此快速檢測(cè)海洋環(huán)境中SRB最重要的是選擇合適的識(shí)別方法。就目前的研究現(xiàn)狀，最合適的SRB識(shí)別方式是通過其特征代謝過程實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB的特異性識(shí)別，因?yàn)榭贵w等生物識(shí)別材料的高選擇性限制了這些生物材料在SRB檢測(cè)中的使用，不可能使用一種生物材料檢測(cè)所有SRB種群的濃度；其次，生物印跡薄膜的選擇性程度較低，能夠產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多。而且這兩類識(shí)別手段的非特異吸附問題無(wú)法得到較好解決，對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾較大。通過特征代謝產(chǎn)物硫化物實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB的特異性識(shí)別，在保證了選擇性的同時(shí)，避免了使用生物識(shí)別材料出現(xiàn)的穩(wěn)定性差、價(jià)格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點(diǎn)。同時(shí)，通過特征代謝產(chǎn)物硫化物實(shí)現(xiàn)對(duì)SRB的特異性檢測(cè)還具有較高的普遍性，源自不同種群的SRB均可以通過這種方法檢測(cè)。

然而，這類檢測(cè)方法仍需較長(zhǎng)的SRB培養(yǎng)時(shí)間以積累代謝產(chǎn)物硫化物。因此，進(jìn)一步的研究將集中在繼續(xù)縮短檢測(cè)時(shí)間，主要是SRB培養(yǎng)時(shí)間方面，這對(duì)識(shí)別材料和檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。