海水環(huán)境中異化鐵還原菌所致金屬材料腐蝕的研究進(jìn)展
摘要
綜述了鐵還原菌 （IRB） 對(duì)海洋中鋼鐵等材料腐蝕影響的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展。闡述了IRB種類和代謝方式的多樣性，介紹了其在代謝過(guò)程中的電子傳遞方式；總結(jié)了海水環(huán)境中IRB所致金屬腐蝕機(jī)理的研究現(xiàn)狀，分析了不同研究者的結(jié)論存在差異的原因；最后介紹了研究IRB腐蝕影響常用的方法，并對(duì)今后的研究方向提出相應(yīng)的建議。
關(guān)鍵詞： 海水腐蝕； 微生物腐蝕； 鐵還原菌； 異化鐵還原
根據(jù)我國(guó)自然資源部發(fā)布的《2018年中國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)統(tǒng)計(jì)公報(bào)》，2018年的全國(guó)海洋生產(chǎn)總值已達(dá)83415億元，占國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值的9.3%，航運(yùn)業(yè)以及海洋相關(guān)產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為當(dāng)今經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要引擎。海洋環(huán)境復(fù)雜多變，高濃度的鹽、溶解氧等因素共同作用造成海洋工程材料的嚴(yán)重腐蝕，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，埋下許多安全隱患。其中，微生物如細(xì)菌、真菌、古菌等在海洋裝備災(zāi)難性事故中扮演的角色引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。這種由于微生物生命活動(dòng)或代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的腐蝕稱為微生物腐蝕 （MIC）。
海洋中已經(jīng)報(bào)道的微生物約有1500多種，具有腐蝕活性的微生物主要有硫酸鹽還原菌 （SRB）、硝酸鹽還原菌 （NRB）、鐵氧化菌 （IOB）、鐵還原菌 （IRB） 和產(chǎn)酸菌 （APB） 等[1]，其主要通過(guò)參與Fe、S等的循環(huán)并改變金屬表面的陰、陽(yáng)極反應(yīng)影響腐蝕過(guò)程[2-4]。自然環(huán)境下，金屬的MIC往往伴隨著生物膜的生成和發(fā)展，生物膜可以為微生物提供適合的生存環(huán)境，對(duì)殺菌劑起到屏障作用，且生物膜不同深度溶解氧、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分等的濃度不同，為微生物之間的協(xié)同作用提供有利環(huán)境。MIC的控制在很大程度上是生物膜的控制[5,6]。SRB由于廣泛存在于無(wú)氧環(huán)境，造成嚴(yán)重的腐蝕后果，被認(rèn)為是最重要的腐蝕微生物。因此，MIC理論大多是以SRB為研究對(duì)象提出的，如經(jīng)典的陰極去極化理論、濃差電池理論、代謝產(chǎn)物腐蝕理論等。而Jia等[6,7]在前人的基礎(chǔ)上通過(guò)分析SRB、APB等微生物在金屬腐蝕過(guò)程中的能量和電子傳遞過(guò)程，提出胞外電子傳遞理論 （EET-MIC）、代謝產(chǎn)物腐蝕理論 （M-MIC） 和生物降解腐蝕理論 （BD-MIC） 的劃分，進(jìn)一步完善了MIC理論。IRB作為海洋環(huán)境中一類重要的微生物，其對(duì)金屬材料的腐蝕影響研究相對(duì)較少，有待進(jìn)一步探索。
地球上的生命活動(dòng)及進(jìn)化與各類元素的循環(huán)息息相關(guān)，其中Fe作為地殼中含量第四位的元素，參與地球上大部分的生命代謝活動(dòng)?，F(xiàn)今的地球表面是一個(gè)固、液、氣三相組成的高度異質(zhì)環(huán)境，F(xiàn)e主要以氧化態(tài)Fe（Ⅲ） 形式存在，但Fe（Ⅲ） 組成的礦物質(zhì)或化合物溶解度極低，生物難以直接吸收。20世紀(jì)80年代以前，人們認(rèn)為S的還原是微生物還原最早的形式，直到1987年分離并培養(yǎng)出第一株具有鐵還原功能的細(xì)菌，人們開(kāi)始意識(shí)到微生物還原Fe（Ⅲ） 可能是地球早期生命的呼吸方式之一，Vargas等[8]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了幾種嗜熱菌相比S更易還原Fe（Ⅲ）。近年來(lái)，隨著不同種類的IRB被陸續(xù)從海水、海泥甚至深海熱液區(qū)等水域環(huán)境中分離提取，其對(duì)金屬材料的腐蝕作用也引起人們的關(guān)注[9]。雖然IRB對(duì)金屬材料的腐蝕影響已取得一些成果，但對(duì)其作用結(jié)果及作用機(jī)制存在爭(zhēng)議。因此，深入系統(tǒng)地探究IRB所致金屬的腐蝕機(jī)制不僅可以進(jìn)一步豐富MIC理論，還對(duì)海洋工程裝備的防護(hù)具有理論指導(dǎo)意義。
本文從IRB種類的多樣性、代謝過(guò)程的多樣性、對(duì)金屬材料的腐蝕機(jī)制研究現(xiàn)狀、腐蝕研究方法等幾個(gè)方面總結(jié)了海水環(huán)境中IRB所致金屬材料腐蝕的研究進(jìn)展。
1 海水環(huán)境中IRB種類的多樣性
IRB并不是一個(gè)分類學(xué)上的概念，而是一類可以將Fe（Ⅲ） 還原為Fe（Ⅱ） 的微生物統(tǒng)稱。Fe（Ⅲ） 的還原也稱為異化鐵還原，微生物通過(guò)氧化電子供體獲得電子，以胞外Fe（Ⅲ） 作為末端電子受體，將Fe（Ⅲ） 還原為Fe（Ⅱ），同時(shí)獲得能量[10]。IRB是一類嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧的細(xì)菌或古菌，生存環(huán)境廣泛，常見(jiàn)的海水環(huán)境中存在的IRB種類如表1所示。其中，深海熱液區(qū)是重要的含鐵氧化物的儲(chǔ)存區(qū)，為異化IRB的生存繁殖提供了電子受體。但是，由于當(dāng)前的技術(shù)限制，熱液區(qū)的樣品不易獲取，并且外部條件改變后菌株不易存活，因此對(duì)深海熱液區(qū)的IRB研究報(bào)道較少。目前在金屬腐蝕領(lǐng)域研究最多的是Shewanella和Geobacter。
表1 海水環(huán)境已知的部分IRB種類
2 IRB代謝過(guò)程的多樣性
微生物在代謝過(guò)程中需要不斷地與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，攝取能量，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物，其本質(zhì)是一系列的氧化還原反應(yīng)，即存在電子供體和電子受體的電子傳遞過(guò)程。IRB從電子供體中獲得電子，再將電子傳遞給Fe（Ⅲ） 使其還原，在此過(guò)程中獲得并儲(chǔ)存能量，有些IRB也可以還原其他有毒重金屬和類金屬，將還原過(guò)程作為自身的一種解毒機(jī)制[24]。
2.1 電子供體
IRB可利用H2、有機(jī)酸作為電子供體，尤其是短鏈有機(jī)酸，如乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽，琥珀酸等；Geoglobus ahangari、Desulfuromonas palmitatis以及Geothrix fermentans可以利用一些長(zhǎng)鏈脂肪酸如硬脂酸、棕櫚酸等；還有少數(shù)幾種可以利用葡萄糖和芳香族化合物作為電子供體，其中利用葡萄糖獲得能量時(shí)大多通過(guò)發(fā)酵路徑，產(chǎn)生乙酸。除此以外，極端環(huán)境分離的超嗜熱菌如Ferroglobus placidus還能在一定條件下以Fe（Ⅱ） 為電子供體[25]。
2.2 電子受體
IRB在代謝過(guò)程中除了以Fe（Ⅲ） 作為電子受體，兼性厭氧的IRB在有氧環(huán)境下還能以O(shè)2為電子受體，Mn（Ⅳ）、胞外苯醌類化合物、富馬酸、含氯化合物、硝酸根等也在一定條件下也可以作為IRB的電子受體[26-28]。其中，Shewanella、Acidiphilium以及Rhodoferax在利用O2作為電子受體時(shí)比Fe（III） 生長(zhǎng)更好，這是因?yàn)樵谥行曰蚱珘A性pH值環(huán)境下Fe（III） 的溶解度和氧化還原電位都比較低，微生物利用O2呼吸可產(chǎn)生更多的能量。在酸性條件下Fe（III） 以Fe3+的形式存在，F(xiàn)e3+的氧化還原電位與O2接近，可同時(shí)利用O2和Fe（III） 進(jìn)行呼吸。
此外，根據(jù)呼吸類型，可以分為呼吸型IRB和發(fā)酵型IRB。其中，呼吸型IRB可以通過(guò)完全或不完全氧化有機(jī)物獲取電子，再傳遞給電子受體，獲取并儲(chǔ)存能量，如Geobacter、Desulfuromonas可以完全將有機(jī)物氧化成CO2，而Shewanella、Pseudomonas不能將有機(jī)物完全氧化為CO2。發(fā)酵型IRB通過(guò)發(fā)酵有機(jī)物獲取能量并進(jìn)行異化鐵還原，但是大部分電子儲(chǔ)存在發(fā)酵代謝產(chǎn)物中，只有極少部分的電子用來(lái)還原Fe（Ⅲ），如Vibrios和Bacillus等。研究者們通過(guò)計(jì)算表明，少量Fe（Ⅲ） 可以促進(jìn)發(fā)酵獲取更多能量[29,30]。因此，呼吸型的IRB更易對(duì)金屬腐蝕產(chǎn)生影響。
2.3 電子傳遞機(jī)制
IRB是通過(guò)向胞外轉(zhuǎn)移電子的代謝方式實(shí)現(xiàn)電子傳遞過(guò)程。目前普遍認(rèn)為，IRB通過(guò)以下幾種機(jī)制傳遞電子 （見(jiàn)圖1）：（a） 直接接觸機(jī)制：細(xì)菌以菌毛作為納米導(dǎo)線或通過(guò)外膜上的活性蛋白，直接接觸鐵氧化物表面釋放電子；（b） 電子穿梭機(jī)制：微生物分泌的氧化還原物質(zhì)攜帶電子傳遞至胞外受體，再以氧化態(tài)返回胞內(nèi)繼續(xù)接受電子，如此往返于胞內(nèi)外的介質(zhì)；（c） 鰲合作用機(jī)制：微生物分泌出復(fù)雜的有機(jī)配位體與不溶性鐵氧化物作用形成可溶性復(fù)合體，溶解性的Fe通過(guò)擴(kuò)散作用到微生物表面，增大微生物與Fe（Ⅲ） 的接觸效率，提高鐵還原速率[31]。在實(shí)際環(huán)境中，這幾種機(jī)制的貢獻(xiàn)還不是很清楚。例如，Geobacter不能產(chǎn)生電子穿梭體及絡(luò)合物，通常被認(rèn)為主要是通過(guò)膜蛋白或產(chǎn)生鞭毛進(jìn)行電子傳遞[32]；而Shewanella能分泌電子穿梭體或螯合物，比如醌、有機(jī)配位基、黑色素等，直接接觸可能就不作為其還原不溶性鐵氧化物的主要途徑[33,34]。
圖1 微生物作用于Fe（Ⅲ） 氧化物表面?zhèn)鬟f電子的3種方式[31]
3 IRB對(duì)金屬材料腐蝕的影響
金屬在海水環(huán)境中的腐蝕過(guò)程大多是電化學(xué)過(guò)程，以鋼鐵的腐蝕為例，腐蝕過(guò)程中必定伴隨著Fe的溶解，電極反應(yīng)中的陽(yáng)極反應(yīng)為：
在有氧環(huán)境下，陰極反應(yīng)很容易發(fā)生，O2迅速將Fe2+氧化為Fe3+，生成鐵的氧化物或氫氧化物。而在無(wú)氧環(huán)境下，電子傳遞給H2O電解的H+，電極反應(yīng)為[5,35]：
當(dāng)微生物參與到腐蝕過(guò)程中時(shí)，其生長(zhǎng)代謝會(huì)通過(guò)不同的途徑改變電化學(xué)過(guò)程，例如微生物生命活動(dòng)分泌能夠促進(jìn)陰極還原的酶而影響電極反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。生物膜結(jié)構(gòu)創(chuàng)造生物膜內(nèi)部的腐蝕微環(huán)境，如降低膜內(nèi)溶解氧、生成抗菌素、分泌緩蝕劑等，改變金屬與體系接觸的表面狀態(tài)，從而改變金屬的腐蝕速率[5,36,37]及新陳代謝產(chǎn)物的腐蝕作用。IRB對(duì)金屬的腐蝕影響近年來(lái)取得一系列研究成果。
3.1 單一IRB作用下的腐蝕過(guò)程
3.1.1 腐蝕促進(jìn)理論
IRB引起金屬材料腐蝕促進(jìn)的MIC理論可總結(jié)為以下幾方面：（1） 被廣泛接受的腐蝕產(chǎn)物保護(hù)膜破壞理論。在一定條件下，鋼鐵表面形成的腐蝕產(chǎn)物膜對(duì)材料起到一定的保護(hù)作用，而IRB能夠?qū)⒈Ｗo(hù)性的Fe（III） 氧化物還原為可溶性的Fe（II），使得金屬在腐蝕環(huán)境中呈現(xiàn)出新鮮的表面，加速金屬腐蝕，其腐蝕機(jī)理如圖2。上個(gè)世紀(jì)80年代，Obuekwe等[38]在微厭氧環(huán)境下研究了一株IRB （Pseudomonas sp.） 對(duì)碳鋼腐蝕的影響，證明了IRB能夠還原和移除由Fe（III） 化合物組成的保護(hù)性膜，促進(jìn)陽(yáng)極反應(yīng)，進(jìn)而加速碳鋼腐蝕。之后，Little等[39]采用電化學(xué)噪聲法研究了另外一株IRB （Shewanella purefaciens） 對(duì)碳鋼腐蝕的影響，結(jié)果也表明IRB在碳鋼表面通過(guò)將固態(tài)Fe（III） 的氧化物還原為可溶性的Fe（II），促進(jìn)碳鋼的腐蝕。（2） 局部腐蝕促進(jìn)理論。IRB可形成不均勻生物膜，影響電化學(xué)過(guò)程，為局部腐蝕提供了條件，整體上表現(xiàn)為碳鋼腐蝕被加速[36]。Chen等[40]采用絲束電極 （WBE） 的方法結(jié)合生物膜的形貌表征研究了一株IRB （Thalassospira. sp.） 在氧飽和海水中所致Q235碳鋼局部腐蝕的動(dòng)態(tài)過(guò)程，結(jié)果表明IRB的存在生成了不均勻的生物膜，且IRB在生物膜內(nèi)的代謝導(dǎo)致了表面膜的局部破壞，產(chǎn)生了電化學(xué)活性位點(diǎn)，促進(jìn)了Q235碳鋼電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程。（3） 氫氧化腐蝕促進(jìn)理論。隨著電化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微區(qū)電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)在腐蝕領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，因此有研究者研究了IRB和H2存在下碳鋼的局部腐蝕[41,42]，證明了IRB的氫氧化會(huì)使碳鋼在短期內(nèi)腐蝕加劇。
圖2 IRB引起的腐蝕促進(jìn)機(jī)理圖
3.1.2 腐蝕抑制理論
隨著對(duì)IRB腐蝕作用研究的深入，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，IRB對(duì)金屬材料起到腐蝕抑制作用，其原因可以總結(jié)為以下幾點(diǎn)：（1） O2消耗腐蝕抑制理論。IRB的存在會(huì)直接或間接地消耗O2，抑制陰極反應(yīng)從而抑制材料的腐蝕[43]。O2在金屬腐蝕過(guò)程中起到重要作用，其氧化還原電位大于Fe（III）的，使得一些兼性IRB更傾向以O(shè)2作為電子受體以獲得更多的能量；同時(shí)，被還原生成的Fe（II） 氧化進(jìn)一步消耗O2，降低體系中的溶解氧，腐蝕機(jī)理模型見(jiàn)圖3。（2） 保護(hù)性產(chǎn)物層腐蝕抑制理論。近期研究表明，一些IRB會(huì)誘導(dǎo)生成具有緩蝕性的保護(hù)層如藍(lán)鐵礦，從而抑制腐蝕。Cote等[44]認(rèn)為Geobacter sulfurreducens以醋酸鹽為碳源將Fe（III） 還原為Fe（II），而Fe （II） 與磷酸根結(jié)合生成磷酸亞鐵 （Fe3（PO4）2·8H2O） 即藍(lán)鐵礦，沉積在碳鋼表面，減少碳鋼的腐蝕。Volkland等[45]也利用IRB在鋼表面成功制備了藍(lán)鐵礦涂層，反應(yīng)如下：
圖3 IRB引起的腐蝕抑制機(jī)理圖
（3） 生物膜腐蝕抑制理論。微生物若在金屬表面生成均勻的生物膜，則會(huì)對(duì)金屬材料起到保護(hù)作用，因?yàn)榫鶆虻纳锬て帘瘟薕2的向內(nèi)擴(kuò)散，有些IRB在生物膜內(nèi)的代謝還會(huì)產(chǎn)生緩蝕劑，抑制腐蝕[37,47]。（4） 電子傳遞腐蝕抑制理論。有研究[48]證明，如果IRB通過(guò)納米導(dǎo)線傳遞電子，該過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生陰極電流，抑制腐蝕。
3.2 混合菌作用下的腐蝕過(guò)程
實(shí)際的海水環(huán)境是復(fù)雜多樣的，MIC在多數(shù)情況下是不同微生物協(xié)同作用的結(jié)果。除了單一菌種，混合菌即兩種及以上的菌種作用下金屬的腐蝕行為也開(kāi)始受到關(guān)注。其中，有研究者報(bào)道了IRB與IOB、銅綠假單胞菌等協(xié)同作用對(duì)金屬腐蝕的影響。
IOB是常見(jiàn)的一類具有腐蝕活性的微生物，代謝過(guò)程中通過(guò)將Fe（II） 氧化成Fe（III） 獲取能量，導(dǎo)致在金屬表面產(chǎn)生氧濃差電池，引起局部腐蝕，腐蝕結(jié)果往往是在管道等金屬表面形成銹瘤[49]，銹瘤又為腐蝕性的厭氧微生物提供厭氧條件，從而造成金屬嚴(yán)重的腐蝕。當(dāng)IRB與IOB同時(shí)存在于體系中時(shí)，IOB以O(shè)2為電子受體，將Fe（II） 氧化成為Fe（III）。而IRB利用生成的Fe（III） 作為電子受體進(jìn)行還原，但一些種類的IRB也傾向于以O(shè)2為電子受體，與IOB形成競(jìng)爭(zhēng)。因此，二者的共同作用對(duì)金屬腐蝕的影響值得探究。IRB與IOB的協(xié)同作用在淡水環(huán)境如自來(lái)水管道等方面研究較多。Wang等[50-52]的一系列研究證實(shí)，IRB與IOB通過(guò)在金屬管道的內(nèi)層和外層形成致密的腐蝕產(chǎn)物膜如α-FeOOH和Fe3O4等抑制管道的腐蝕。海水環(huán)境中其協(xié)同作用對(duì)腐蝕過(guò)程的影響研究較少。其中，Lee等[53]和Chen等[54]分別研究了不同種類的IRB和IOB混合菌作用對(duì)碳鋼腐蝕的影響，結(jié)果均表明在有氧環(huán)境中IRB的加入會(huì)降低體系中O2含量，從而抑制陰極反應(yīng)的進(jìn)行，緩解IOB的腐蝕作用。
銅綠假單胞菌也是一種常見(jiàn)的微生物，廣泛存在于各類環(huán)境中。Black等[55]在微好氧條件下，研究了低碳鋼中銅綠假單胞菌和IRB共存的腐蝕效應(yīng)，認(rèn)為IRB去除保護(hù)性鐵氧化物的能力導(dǎo)致銅綠假單胞菌進(jìn)一步引起陽(yáng)極極化導(dǎo)致腐蝕加速。
3.3 IRB影響腐蝕復(fù)雜性的原因剖析
IRB對(duì)海洋工程裝備材料的腐蝕作用是不容忽視的，而現(xiàn)有的研究成果存在爭(zhēng)議的主要原因可以概括為以下兩點(diǎn)：
（1） IRB是一類具有鐵還原能力的微生物，種類繁多，分布在不同的水域環(huán)境，因此，不同種類的IRB代謝過(guò)程中對(duì)電子受體和電子供體的選擇不同。其中O2是一個(gè)影響IRB電子受體選擇的重要因素，其氧化還原電位高于Fe（III），理論上有氧條件下兼性IRB趨向以O(shè)2作為電子受體，消耗體系中的O2，抑制腐蝕；而無(wú)氧條件下，IRB原則上以Fe（III） 等金屬氧化物為電子受體，破壞腐蝕產(chǎn)物保護(hù)膜，可能會(huì)造成腐蝕加速。因此，不同種類的IRB在不同環(huán)境下對(duì)電子受體的選擇不同，就會(huì)造成結(jié)果上的差異，很難進(jìn)行系統(tǒng)對(duì)比。
（2） 生物膜的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的生物/化學(xué)過(guò)程，對(duì)腐蝕過(guò)程的影響很難預(yù)測(cè)和控制，其組成受環(huán)境中微小擾動(dòng) （如溫度、營(yíng)養(yǎng)濃度和流量） 的影響，生物膜的狀態(tài)會(huì)造成材料腐蝕的較大差異?，F(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)雖然已經(jīng)在電化學(xué)檢測(cè)、生物膜檢測(cè)等方面得到了很大的改善，但生物膜內(nèi)部的微環(huán)境如溶解氧、酸堿度、離子種類等還未能實(shí)現(xiàn)精確的跟蹤檢測(cè)。
4 IRB腐蝕影響的研究方法
4.1 腐蝕過(guò)程與產(chǎn)物測(cè)試
4.1.1 失重法
失重法測(cè)量腐蝕速率是一種簡(jiǎn)單可靠的方法。在IRB腐蝕影響的研究過(guò)程中，失重法被廣泛應(yīng)用。打磨后的樣品在置于腐蝕體系中之前稱重，浸泡一定的時(shí)間后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法除去樣品表面的生物膜及腐蝕產(chǎn)物后再稱重，前后重量差值即為失重量。利用失重法可以得到一個(gè)直觀、相對(duì)準(zhǔn)確的腐蝕速率，但耗時(shí)較長(zhǎng)且不易得到動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[6]。
4.1.2 電化學(xué)方法
相較于失重法，利用電化學(xué)手段研究IRB對(duì)金屬表面腐蝕過(guò)程熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)過(guò)程的影響，可以得到快速準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果，是傳統(tǒng)失重等方法不可比擬的。電化學(xué)阻抗譜 （EIS） 測(cè)試技術(shù)是研究金屬腐蝕最常用的方法之一，該技術(shù)對(duì)被測(cè)體系擾動(dòng)小，即使擾動(dòng)信號(hào)長(zhǎng)時(shí)間作用于電極，也不會(huì)給被測(cè)電極表面造成大的影響。極化曲線測(cè)量是腐蝕電化學(xué)研究的重要手段，線性極化 （LPR） 對(duì)研究電極在腐蝕電位附近外加電流進(jìn)行微極化，通常選用相對(duì)開(kāi)路電位±10 mV的掃描范圍以最大限度接近體系的真實(shí)狀態(tài)，通過(guò)計(jì)算電位對(duì)電流的斜率得到極化電阻 （Rp），可表征金屬腐蝕速率；而通過(guò)Tafel極化得到的腐蝕電流 （icorr），不僅可以分析電極表面物質(zhì)傳輸及腐蝕機(jī)理，還可以換算得到直觀的腐蝕速率。
利用傳統(tǒng)的電化學(xué)手段測(cè)試得到的是電極整體的電化學(xué)行為，不能提供某一微小區(qū)域的狀態(tài)，微區(qū)電化學(xué)測(cè)試技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，彌補(bǔ)了普通電化學(xué)的不足。例如，局部電化學(xué)阻抗 （LEIS） 是通過(guò)向被測(cè)電極施加一個(gè)微擾電壓，可以精確測(cè)量局部區(qū)域固/液界面的阻抗行為[56]，從而分析局部腐蝕速率和生物膜下的差異。此外，掃描電化學(xué)顯微鏡 （SECM），掃描振動(dòng)電極 （SVET）、掃描Kelvin探針 （SKP） 等微區(qū)電化學(xué)技術(shù)也得到相應(yīng)的發(fā)展和應(yīng)用。
4.1.3 腐蝕產(chǎn)物表征
金屬表面的腐蝕產(chǎn)物形貌及成分分析對(duì)研究IRB影響下的腐蝕機(jī)制是不可或缺的。目前最常用的微觀形貌表征手段有掃描電子顯微鏡 （SEM）、透射電子顯微鏡 （TEM），與其聯(lián)用能譜 （EDS） 可進(jìn)行元素分析。而腐蝕產(chǎn)物的物相分析常采用X射線衍射 （XRD）、X射線光電子能譜 （XPS）、Raman光譜分析等，多種方法相互驗(yàn)證，為確定產(chǎn)物成分提供可靠論證。
4.2 生物學(xué)研究方法
研究IRB對(duì)金屬腐蝕的影響時(shí)，IRB的種類及其代謝特點(diǎn)、附著生物膜特征等信息必不可少，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為此提供了有力的工具。
4.2.1 IRB的分類
微生物的分類方法包括單菌株測(cè)序、宏基因高通量測(cè)序等。應(yīng)用基因序列分析可鑒定生物之間的親緣性，確定細(xì)菌分類及代謝特點(diǎn)，分析群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性。其中，16SrRNA基因測(cè)序可以對(duì)特定環(huán)境下細(xì)菌和古菌的IRB種類和豐度進(jìn)行有效的鑒定；而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （PCR） 在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的DNA片段，用于序列分析、基因表達(dá)調(diào)控等。
4.2.2 生物膜表征
被微生物附著的樣品經(jīng)過(guò)超臨界脫水后可以保留完整的微生物和胞外多聚物 （EPS） 形貌，在SEM下可以觀察到其在金屬表面的附著狀態(tài)，但SEM無(wú)法給出細(xì)菌的存活狀態(tài)和生物膜厚度。激光掃描共聚焦顯微鏡 （CLSM） 可以有效解決這一問(wèn)題。觀察前用不同的染料對(duì)含生物膜樣品進(jìn)行染色，生物膜中不同的成分與特定的染料結(jié)合，在CLSM下會(huì)激發(fā)出不同的熒光，確定生物膜中不同組分的分布情況。例如，用Live/Dead染料染色后的細(xì)菌，活細(xì)胞顯示為綠色，而死細(xì)胞顯示為紅色，同時(shí)可以進(jìn)行3D圖像采集，既可以獲得細(xì)菌在金屬表面的存活狀態(tài)，也可以獲得直觀的生物膜厚度。
4.2.3 基因敲除
分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得基因敲除技術(shù)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，根據(jù)生物種類的不同，主要用到RecA系統(tǒng)同源重組法、CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除法和基于自殺載體的同源重組法等[57]。在IRB電子傳遞方式的研究過(guò)程中，通過(guò)敲除與電子傳遞相關(guān)的酶基因，可以進(jìn)一步確定IRB的電子傳遞機(jī)制，Geobacter作為模式菌種已有所研究。例如，Summers等[58]利用基因敲除手段去除Geobacter sulfurreducens菌株中的色素蛋白Omcs （一種調(diào)節(jié)c型細(xì)胞色素的蛋白） 基因，再與Geobacter metallireducens構(gòu)建共培養(yǎng)體系后證明了Geobacter sulfurreducens的導(dǎo)電纖毛參與種間直接電子傳遞的機(jī)制。Liu等[59]敲除Geobacter sulfurreducens菌株的Omcs基因后認(rèn)為，納米磁鐵礦會(huì)促進(jìn)Geobacter sulfurreducens和Geobacter metallireducens的直接電子傳遞過(guò)程。但是，由于IRB種類的復(fù)雜性和技術(shù)的局限，大部分IRB菌株還未見(jiàn)應(yīng)用。在MIC研究領(lǐng)域，利用基因敲除技術(shù)去除與微生物腐蝕活性表達(dá)有關(guān)的基因，有助于明確微生物對(duì)金屬腐蝕產(chǎn)生影響的直接因素，目前已應(yīng)用在SRB、銅綠假單胞菌等所致金屬腐蝕的研究中。例如，Huang等[60]通過(guò)基因敲除證實(shí)了銅綠假單胞菌中的phzM和phzS基因片段調(diào)控X80碳鋼的EET-MIC。但是在IRB所致金屬腐蝕的機(jī)制研究中，基因敲除的應(yīng)用還比較少，具有較大的應(yīng)用前景。
5 結(jié)語(yǔ)
綜上所述，IRB作為一類重要的鐵代謝菌，研究其對(duì)海水環(huán)境中金屬的腐蝕影響意義重大。結(jié)合研究現(xiàn)狀，針對(duì)存在的問(wèn)題提出幾點(diǎn)建議：第一，體系中參數(shù)的控制 （如溶解氧） 對(duì)研究IRB的腐蝕作用非常關(guān)鍵，尤其是有氧環(huán)境下應(yīng)盡量減少溶解氧變化產(chǎn)生的影響，可以采用通氧或通空氣的方式使體系內(nèi)溶解氧保持濃度；第二，對(duì)生物膜內(nèi)部微環(huán)境檢測(cè)手段的提升和改善對(duì)研究IRB腐蝕影響機(jī)理具有重要意義；第三，IRB對(duì)O2的消耗容易造成貧氧環(huán)境，在實(shí)際海洋環(huán)境中能夠?yàn)閰捬蹙峁┯欣纳姝h(huán)境，IRB與其他微生物混合作用所致腐蝕的機(jī)理需要進(jìn)一步研究。