磁場對純Cu微生物腐蝕行為的影響

Cu及銅合金因其具有優(yōu)異的耐蝕性、可加工性、導熱性和電導率低等特點，在海洋工程設施中廣泛應用[1,2]。在海洋環(huán)境中大多數(shù)合金遭受由海洋細菌引起的微生物腐蝕 （MIC），目前有大量關于好氧菌對銅合金微生物腐蝕行為的報道[2,3,4,5,6]，研究表明樣品表面細菌生物膜的附著會影響Cu及其合金的腐蝕。

海洋環(huán)境中，船舶等海洋工程設施在移動過程中產(chǎn)生電磁場，影響細菌的生理活動[7,8]和金屬材料腐蝕[9,10,11]。磁場通過改變?nèi)芤旱膒H值[12]，抑制傳質過程[13,14]等方式影響材料的腐蝕。目前研究[15]表明，磁場可以抑制Cu的腐蝕速率，通過延遲表面Cu2O的形成及促進CuCl2-的擴散來影響Cu的腐蝕。另外磁場也會影響微生物的生理活動[16]。一些研究[8]表明，隨著時間、溫度和磁場強度的增大，細菌的數(shù)量及其生存力下降。磁場還會影響細菌生物膜的形成，殺死部分微生物，減緩細菌生長。近年來，研究者們對磁場抑制或去除細菌生物膜的形成很感興趣，有研究[17]表明低磁場強度 （2~4 mT） 通過控制硫酸鹽還原菌 （SRB） 活性降低了304不銹鋼的MIC，延遲金屬表面上生物膜的形成。磁場抑制鐵氧化細菌 （IOB） 的生長且在碳鋼表面生成更致密的生物礦化膜[18]。MIC是不同微生物之間相互協(xié)同作用的結果，然而實際環(huán)境中并不是單一的細菌，細菌群落之間通過群體感應相互作用，這種相互作用在生物膜中尤為明顯，會使生物膜的官能團改變，影響細菌分布及產(chǎn)生的生物總量[19]。近年來人們逐漸開始研究多細菌生物膜的作用[20]。目前有研究顯示，與鑄鐵在單個細菌溶液中相比，銅綠假單胞菌和SRB兩種細菌共同存在時鑄鐵的腐蝕速率有所變化，細菌在樣品表面吸附的生物膜含量也有所不同[21]。因此，研究混合細菌對材料的腐蝕是很有必要的。雖然已有大量關于磁場對腐蝕行為影響的報道，但是關于在非順磁性離子溶液中非鐵磁電極的磁場效應的研究很少，目前沒有關于磁場和混合好氧細菌對純Cu腐蝕影響的報道。由于其在海洋環(huán)境中的大量應用，有必要對其進行研究。

本研究探討了磁場與混合海洋細菌共同存在的條件下純Cu的腐蝕規(guī)律，通過電化學方法和表面分析技術研究了磁場對于銅微生物腐蝕的影響，為其在工業(yè)上的應用打下基礎。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料是10 mm×10 mm×5 mm的純Cu。樣品通過240，400，800，1500和2000#的砂紙依次打磨并拋光，隨后在無水乙醇中超聲清洗5 min清除表面雜質及污染物，用N2吹干備用。實驗前將樣品置于紫外燈下滅菌30 min。

從舟山海域采集并分離出4種海洋細菌，通過中國海洋微生物菌種保藏管理中心鑒定，分別為弧菌 （Vibrio sp.），威尼斯不動桿菌 （Acinetobacter venetianus），河流弧菌 （Vibrio fluvialis），咸海鮮芽孢桿菌 （Jeotgalibacillus sp.）。細菌在模擬海水中進行富集培養(yǎng)，模擬海水的具體成分為：23.476 g/L NaCl，10.61 g/L MgCl2·6H2O，0.780 g/L CaCl2·6H2O，0.192 g/L NaHCO3，3.917 g/L Na2SO4，0.667 g/L KCl，0.096 g/L KBr，0.026 g/L硼酸，其余為蒸餾水，另外加入3 g/L的魚粉蛋白胨作為碳氮營養(yǎng)源[22]。用3 mol/L NaOH溶液緩慢調節(jié)細菌培養(yǎng)基的pH值至7.7±0.2。隨后放入高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌 （加熱至121 ℃保溫20 min），取出冷卻至室溫待用。

實驗采用的是相互平行的Nd-Fe-B磁鐵 （異名磁極相對） 作為靜磁場裝置，放置于試樣兩側，保證試樣處于磁場中心，磁場方向與試樣表面垂直。由Tesla meter測量磁場強度，實驗中所用的磁場強度分別為28和60 mT。

1.2 測試方法

實驗采用比濁法測定細菌的生長曲線，利用SpectraMax 190光吸收型酶標儀測定細菌的吸光度 （OD值） 來推知菌液濃度，測量有、無磁場條件下經(jīng)稀釋100倍的混合細菌在模擬海水培養(yǎng)液中生長7 d的OD值，將所測得的OD值與對應的培養(yǎng)時間作圖即可繪制出混合細菌的生長曲線。實驗中選用的波長是600 nm。

純Cu樣品浸入有/無磁場的含菌海水中10 d后，用超凈水清洗，放入戊二醛消毒液中浸泡2 h后，分別用50%，75%和100% （體積分數(shù)） 乙醇溶液進行梯度洗脫，N2吹干，在場發(fā)射掃描電鏡 （FE-SEM，F(xiàn)EIQuanta FEG 250） 下觀察樣品表面形貌。然后在磷酸緩沖鹽溶液 （PBS） 中超聲10 min，去除掉表面的生物膜，觀察去除生物膜后的表面形貌。Cu表面的腐蝕產(chǎn)物通過Axis Ultra DLD 型X射線光電子能譜儀 （XPS） 進行分析。

利用激光共聚焦顯微鏡 （CLSM，LeiCa TCS SP5） 觀察純Cu表面細菌的吸附情況。將試樣取出后，用3 μL/L 熒光染色劑SYT09 對Cu表面進行染色處理，避光靜置20 min，用超凈水將表面的染色劑沖洗掉，N2吹干后用CLSM觀察。

將10 mm×10 mm×5 mm的塊狀樣品，以10 mm×10 mm作為工作面，非工作面用環(huán)氧樹脂封涂，背面用Cu導線點焊導出，用于電化學測試。電化學實驗儀器為PGSTAT302 Autolab電化學工作站。采用標準的三電極體系：工作電極為純Cu，參比電極為飽和甘汞電極 （SCE），輔助電極為Pt電極。測量有/無磁場條件下浸泡1，3，5，7和10 d后樣品的電化學阻抗譜 （EIS），EIS在自腐蝕電位下測試，激勵信號為10 mV的正弦波，測試頻率范圍為105~10-2 Hz。極化測試掃描范圍為相對于開路電位±250 mV，掃描速率為0.2 mV/s。

純Cu樣品浸入有/無磁場的含菌溶液中10 d后，用Fourier變換紅外光譜儀 （FTIR，Agilent Cary660） 來分析樣品表面吸附的生物膜內(nèi)特征官能團[23]。紅外光譜掃描范圍為4000~500 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為2 cm-1。

2 結果與討論

2.1 磁場對細菌生長情況的影響

圖1為細菌在有/無磁場條件下的生長情況。由于采用的是半連續(xù)培養(yǎng)，所以其生長曲線沒有典型的對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期等特征。如圖所示，不同磁場對細菌生長的影響不同。無磁場條件下培養(yǎng)20 h后細菌的生長速度達到最大值，之后保持穩(wěn)定；28 mT下培養(yǎng)24 h后達到最大值，之后保持穩(wěn)定，且細菌數(shù)量少于無磁場條件；而60 mT下培養(yǎng)40 h后細菌數(shù)量達到最大值且數(shù)量多于無磁場條件下的，之后變得穩(wěn)定。

圖1   有/無磁場條件下細菌的生長曲線

2.2 磁場條件下純Cu表面微生物腐蝕形貌分析

樣品浸泡在含菌溶液中時，細菌會逐漸吸附在樣品表面并分泌胞外分泌物 （EPS），這些分泌物將細菌牢牢吸附在樣品表面，形成了微生物從可逆吸附向不可逆吸附的轉變，生物膜從游離態(tài)向固著態(tài)轉變，生成特殊的次級代謝產(chǎn)物[24]。圖2為純Cu在不同磁場條件下浸泡不同時間后表面形貌的SEM像?？梢钥闯?，純Cu表面由細菌分泌的代謝產(chǎn)物形成的生物膜和Cu的氧化膜組成，隨著時間的延長，樣品表面的生物膜會發(fā)生剝落；施加磁場后，樣品表面生物膜形成和剝落的速度加快，且60 mT比28 mT磁場條件下生物膜形成與剝落的速度更快。

圖2   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中分別浸泡不同時間后的SEM 像

去除掉樣品表面的腐蝕產(chǎn)物后 （圖3），兩種條件下樣品表面都發(fā)生了點蝕，28 mT磁場條件下無明顯變化，而60 mT磁場條件下純Cu表面更為致密。用CLSM觀察點蝕坑的形貌和深度，浸泡10 d后Cu表面有很多點蝕坑，在無磁場條件下點蝕坑的平均深度為4.59 μm，28 mT磁場條件下點蝕坑平均深度為3.47 μm，60 mT磁場條件下點蝕坑平均深度為2.47 μm。這些數(shù)據(jù)表明，磁場能抑制Cu的腐蝕，磁場強度為60 mT時比28 mT時抑制效果更明顯。

圖3   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中浸泡10 d后去除表面腐蝕產(chǎn)物后的SEM像

2.3 磁場對生物膜結構的影響

圖4顯示了Cu在有/無磁場的含菌溶液中浸泡不同時間后的CLSM圖。無磁場條件下，Cu在溶液中浸泡1 d后大量細菌附著在表面上 （圖4a）；7 d后Cu表面形成均勻的生物膜 （圖4d），但大多數(shù)細菌已經(jīng)死亡；在10 d后可以清楚地觀察到生物膜持續(xù)生長，此時受損細胞的數(shù)量顯著增加并且生物膜變得不均勻 （圖4g）。28 mT磁場下，浸泡1 d后Cu表面附著的細菌數(shù)量減少，覆蓋有一層均勻的生物膜；7 d后生物膜變得疏松；10 d后樣品表面又形成更加均勻的生物膜。60 mT條件下，浸泡1 d后Cu表面形成致密均勻的生物膜；7 d后表面生物膜疏松；浸泡10 d后生成均勻的生物膜。明顯可見，磁場可以加快生物膜形成與剝落的速度，且磁場強度為60 mT時銅表面生物膜的附著速率比28 mT條件下的更快，更易形成生物膜。

圖4   純Cu在不同磁場強度的含菌溶液中浸泡不同時間后的CLSM圖

生物膜內(nèi)包含多種物質，如EPS中的多聚糖、蛋白質以及核酸等，測定這些物質在生物膜中的含量和分布是深入了解微生物腐蝕機理的重要步驟，可使用FTIR來分析生物膜的成分。圖5為純Cu在有/無磁場條件下浸泡10 d后表面生物膜的FTIR譜?？梢钥闯觯写艌鰰r官能團對應的峰值強度顯著降低。浸泡10 d后，有/無磁場條件下均在3200 cm-1附近 （3700~3300 cm-1為羥基和氨基的疊加吸收區(qū)） 有水分子和蛋白質的O—H和N—H的伸縮振動吸收峰[25]；2929和2962 cm-1附近對應的是CH2和CH3的伸縮振動峰，表明生物膜結構中存在脂肪酸[26]，60 mT磁場條件下該峰消失。在1652 cm-1附近對應蛋白質酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動吸收峰，且有磁場時該峰的強度顯著降低，表明磁場條件下該物質含量減少。在1552 cm-1附近對應蛋白質酰胺Ⅱ帶的N—H的彎曲振動/C—N的伸縮振動，酰胺Ⅰ和Ⅱ帶特征吸收峰的出現(xiàn)說明有/無磁場條件下樣品表面均有蛋白質生成。1324 cm-1附近對應的是—O—H鍵的伸縮振動峰，施加磁場時該峰消失。1249 cm-1附近對應蛋白質酰胺Ⅲ帶C=N的伸縮振動吸收峰，60 mT磁場條件下該峰消失。在1118和1124 cm-1附近對應的是C—O的收縮振動峰，表明有多糖類物質存在[27]。在845和855 cm-1附近對應的是α型糖苷鍵的指紋吸收峰[25]。

圖5   Cu在未施加磁場與施加磁場的溶液中浸泡10 d后表面生物膜的FTIR譜

FTIR結果表明，生物膜結構由脂質、蛋白質和碳水化合物組成，但隨著磁場的增大，脂質含量減少。相比無磁場條件，磁場強度為28 mT時蛋白質含量降低，碳水化合物含量增多。60 mT條件下生物膜結構有所變化，主要由蛋白質和碳水化合物組成，且相比于無磁場條件蛋白質含量降低，碳水化合物含量增多。磁場對生物膜結構的這些影響可能導致樣品表面生物膜的性質發(fā)生改變，從而導致Cu在有/無磁場溶液中的耐腐蝕性能產(chǎn)生差異。

2.4 磁場對Cu表面腐蝕產(chǎn)物的影響

為了更好地理解磁場對Cu微生物腐蝕的影響，用XPS對不同條件下Cu的腐蝕產(chǎn)物進行分析。圖6為腐蝕產(chǎn)物中的Cu 2p，C 1s，O 1s和N 1s元素的XPS結果。表1是各元素的峰值結合能及其對應成分的具體參數(shù)。結果表明，靜磁場可以改變銅腐蝕產(chǎn)物的成分。無磁場時，結合能為531.3和530.2 eV O1s峰分別對應的是C—O鍵和Cu2O[28,29]；28 mT條件下，結合能為530.5和529.1 eV的O1s峰分別對應的是Cu2O和CuO；而60 mT磁場中，結合能為532.0和533.2 eV的O1s峰分別對應的是有機官能團C=O和C—O。C 1s用來分析樣品表面存在的有機化合物，無磁場時，結合能為283.9，285.4和287.7 eV的C1s峰分別對應的是C=C鍵，C=N鍵和C=O/CO2[30,31]；28 mT條件下，結合能為282.2，283.7，285.6 eV的C1s峰分別對應的是C—O，C=C和C—N鍵。60 mT條件下，結合能為285.0，285.8和288.3 eV的C1s峰分別對應的是C—C，C=N鍵和C—O鍵。無磁場條件下N1s的兩處峰值399.1和400.3 eV對應的是=N—和C—NH2兩種官能團[32]，28 mT條件下，398.0和399.2 eV峰值對應的是=N—和酰胺中的C—N—C鍵[27]，60 mT條件下401.3 eV峰值對應的是N雜環(huán)與銅配位形成的N=Cu。對于Cu，樣品表面主要是CuO和Cu2O[15,33,34,35]。

圖6   有/無磁場條件下含菌溶液中浸泡10 d 后銅表面腐蝕產(chǎn)物的XPS分析

表1   純Cu在有/無磁場條件下的溶液中浸泡10 d后表面腐蝕產(chǎn)物的C、O、N和Cu的XPS光譜的擬合參數(shù)

C1s，N1s和O1s峰值強度和面積變化起因于Cu表面生物膜成分與厚度的變化。從表1中可看出，有/無磁場條件下各元素含量發(fā)生變化，施加磁場后O和Cu含量增大，且含量隨著磁場強度增大而增大。施加磁場，溶液溶解氧能力提高，加速Cu的氧化[36]，在樣品表面形成均勻致密的氧化膜，同時阻止海水中Cl-侵蝕，抑制Cu的腐蝕。有/無磁場條件下，O，C，N峰值處的結合能對應的官能團有所不同，進一步表明磁場影響樣品表面生物膜的成分，這與FTIR結果一致。

2.5 微生物環(huán)境下磁場對純Cu電化學腐蝕行為的影響

2.5.1 極化曲線

圖7為純Cu樣品在不同磁場強度的溶液中浸泡10 d后的動電位極化曲線，利用Tafel直線外推法得到的電化學參數(shù)見表2。從圖7和表2可以看出，Cu在有/無磁場的溶液中浸泡10 d后，磁場作用下的樣品腐蝕速率降低，自腐蝕電位Ecorr負移，腐蝕電流密度Icorr從無磁場時的1.74 μA/cm-2下降到28 mT時的0.637 μA/cm-2，60 mT的腐蝕電流密度為0.559 μA/cm-2，達到了最低值。這一變化趨勢與阻抗圖顯示的一致，純Cu耐蝕性增強主要與表面覆蓋的生物膜及氧化膜有關[37]。

圖7   不同磁場條件下Cu在含菌溶液中浸泡10 d后的極化曲線

表2   Cu在未施加磁場和施加磁場的溶液中浸泡10 d后的極化參數(shù)

2.5.2 電化學阻抗譜

圖8為純Cu樣品在有/無磁場的溶液中浸泡不同時間后的Nyquist圖和Bode圖。可以看出，在有/無磁場條件中容抗弧半徑隨著浸泡時間延長先增大后減少，在3 d達到了最大值；浸泡0~3 d后，容抗弧半徑逐漸增大，說明電極表面的吸附平衡偏向吸附[38]，這段時間內(nèi)生物膜逐漸形成起到了保護作用；隨著浸泡時間的延長，容抗弧半徑逐漸減少，表明膜層發(fā)生局部破裂。圖9是對阻抗曲線進行擬合后的等效電路圖[39,40]，其中圖9a代表純Cu在無磁場條件下EIS對應的等效電路，圖9b代表純Cu在磁場條件下EIS對應的等效電路，表3列出了通過擬合得到的電化學參數(shù)。其中，Rs代表溶液介質電阻，Rct為電荷轉移電阻，Rb代表微生物膜電阻，Rf代表樣品表面腐蝕氧化產(chǎn)物電阻，Rp代表樣品表面腐蝕產(chǎn)物膜電阻和細菌生物膜電阻。由于樣品的不均勻性，在等效電路中用常相位角元件 （CPE） 來代替電容，它的阻抗為：

圖8   Cu浸泡在不同磁場強度的含菌溶液中的Nyquist圖和Bode圖

圖9   Cu在有/無磁場條件下的溶液中浸泡10 d后EIS擬合所用等效電路

表3   Cu在未施加磁場和施加磁場的溶液中浸泡不同時間后的電化學阻抗譜擬合參數(shù)

CPEdl表示雙電層電容，CPEp代表氧化產(chǎn)物和微生物膜電容，CPEf為樣品表面腐蝕氧化產(chǎn)物電容，CPEb為微生物膜電容。

表3的電化學參數(shù)中，腐蝕初期 （0~3 d），Rct值先增大而后減緩，進一步表明試樣表面形成了完整的生物膜而后生物膜剝落，這與CLSM結果一致。從圖8和表3中可以看出，存在磁場條件下的容抗弧半徑大于無磁場條件下的容抗弧半徑，施加磁場后0~3 d Rct值增大，Cu表面腐蝕產(chǎn)物增多，表明磁場通過抑制質量轉移過程影響Cu的腐蝕。之后，Rct值減小，主要是由于溶液中Cl-擴散加速傳質過程。從圖8d~f中也可以看出，有/無磁場條件下最大相位角都隨著Cu在溶液中浸泡時間的延長而增大，表明隨著浸泡時間延長表面氧化層厚度增大，同時表明氧化層不是抑制Cu腐蝕過程的主要原因。結合阻抗譜和等效電路可以看出，無磁場條件下，存在兩個時間常數(shù)，純Cu表面的生物膜和氧化膜共同作用來影響純Cu的腐蝕；磁場條件下存在3個時間常數(shù)，磁場作用下樣品表面生物膜形成和剝落的速度加快，在此過程中生物膜會單獨影響Cu的腐蝕行為。從Bode圖中可看出，與無磁場相比，施加28 mT磁場條件下相位角幅度變大，樣品表面的腐蝕產(chǎn)物層增厚，有一定的物理阻隔效應，且相位角峰值向低頻區(qū)移動，峰值增大，樣品表面生成較為完整的生物膜，對樣品起保護作用，腐蝕速率降低。施加60 mT磁場條件下，相位角峰值向低頻區(qū)移動，高頻區(qū)相位角的峰值增大，樣品表面形成由腐蝕產(chǎn)物和生物膜組成的較完整的膜層，對樣品起保護作用，腐蝕速率降低。且磁場強度為60 mT時比28 mT時對Cu腐蝕的抑制效果更明顯。

磁場通過抑制質量轉移過程來抑制Cu的腐蝕，Cu在海水中主要遭受溶解氧和Cl-的侵蝕，反應如下所示：

施加磁場會抑制上述反應，降低Cu的腐蝕速率。且有文獻報道施加磁場后溶液中溶解氧能力增大，O2含量增多，加速Cu表面氧化[41]。此時，Cu在海水中的反應為：

樣品表面生成更多的Cu2O，這與上述XPS分析的結果一致。施加磁場影響表面生物膜的結構與成分，加速生物膜的形成與剝落，磁場作用下樣品表面形成更加均勻致密的生物膜，減少了溶解氧與Cu表面之間的相互作用，使得Cu的腐蝕速率降低。

3 結論

（1） 隨著磁場強度的增大，脂質含量降低。無磁場時，生物膜主要由脂質、蛋白質、碳水化合物組成；磁場強度為28 mT條件下，生物膜主要由脂質、蛋白質、碳水化合物組成，但相比于無磁場條件下，蛋白質含量降低，碳水化合物含量增多；磁場強度為60 mT條件下生物膜主要成分是蛋白質和碳水化合物。

（2） 磁場加快Cu表面生物膜形成與剝落的速度，且磁場強度越大，Cu表面形成生物膜的速度越快。

（3） 與未施加磁場比較，純Cu在施加磁場條件下的Rct值顯著提高，腐蝕電位明顯負移，腐蝕電流密度減少，表明磁場可以抑制純Cu在混合海洋細菌環(huán)境中的腐蝕，且磁場強度為60 mT時比28 mT對Cu的腐蝕抑制作用更明顯。